Օձի թույնի կարբոքսիլ էսթեր կապի վրա գործող ֆերմենտներ

Օձի թույնը պարունակում է ֆերմենտներ, որոնք հիդրոլիզացնում են կարբոքսիլ էսթերային կապերը։Հիդրոլիզի սուբստրատներն են ֆոսֆոլիպիդները, ացետիլխոլինը և արոմատիկ ացետատը:Այս ֆերմենտները ներառում են երեք տեսակի՝ ֆոսֆոլիպազ, ացետիլխոլինէսթերազ և անուշաբույր էսթերազ։Օձի թույնի մեջ արգինին էսթերազը կարող է նաև հիդրոլիզացնել սինթետիկ արգինինը կամ լիզինը, սակայն այն հիմնականում հիդրոլիզացնում է բնության մեջ սպիտակուցային պեպտիդային կապերը, ուստի այն պատկանում է պրոթեզերոնին։Այստեղ քննարկված ֆերմենտները գործում են միայն էսթերային սուբստրատների վրա և չեն կարող գործել որևէ պեպտիդային կապի վրա:Այս ֆերմենտներից առավել կարևոր են ացետիլխոլինէսթերազի և ֆոսֆոլիպազի կենսաբանական գործառույթները, որոնք ամբողջությամբ ուսումնասիրվել են։Որոշ օձերի թույններ ունեն ուժեղ անուշաբույր էսթերազային ակտիվություն, որը կարող է հիդրոլիզացնել p-nitrophenyl ethyl ester, a – or P-naphthalene acetate և indole ethyl ester:Դեռևս անհայտ է, թե արդյոք այս ակտիվությունն առաջանում է անկախ ֆերմենտի կամ կարբոքսիլեստերազի հայտնի կողմնակի ազդեցության միջոցով, էլ չենք խոսում դրա կենսաբանական նշանակության մասին:Երբ Agkistrodon halys Japonicus-ի թույնը փոխազդեց պ-նիտրոֆենիլ էթիլ էսթերի և ինդոլ էթիլ էսթերի հետ, p-nitrophenol-ի և indole phenol-ի հիդրոլիզատները չհայտնաբերվեցին.Ընդհակառակը, եթե այս եթերները փոխազդեն կոբրայի Zhoushan ենթատեսակների օձի թույնի և Bungarus multicinctus օձի թույնի հետ, նրանք արագ հիդրոլիզացված կլինեն:Հայտնի է, որ կոբրայի այս թույներն ունեն ուժեղ խոլինէսթերազային ակտիվություն, որը կարող է պատասխանատու լինել վերը նշված սուբստրատների հիդրոլիզի համար։Փաստորեն, Mclean et al.(1971 թ.) հաղորդում է, որ կոբրաների ընտանիքին պատկանող օձերի շատ թույններ կարող են հիդրոլիզացնել ինդոլ էթիլ էսթերը, նաֆթալինի էթիլ էսթերը և բուտիլնաֆթալինի էսթերը:Օձի այս թույնը ծագում է.

Օձի թույնը կարող է հիդրոլիզացնել մեթիլ ինդոլ էթիլ էսթերը, որը հանդիսանում է շիճուկում խոլինէսթերազի ակտիվությունը որոշելու համար, սակայն այս օձի թույնը խոլինէսթերազային ակտիվություն չի ցուցաբերում:Սա ցույց է տալիս, որ կոբրայի թույնի մեջ կա անհայտ էսթերազ, որը տարբերվում է խոլինեստերազից։Այս ֆերմենտի բնույթը հասկանալու համար անհրաժեշտ է հետագա տարանջատման աշխատանքներ:

1, ֆոսֆոլիպազ A2

(I) Ընդհանուր ակնարկ

Ֆոսֆոլիպազը ֆերմենտ է, որը կարող է հիդրոլիզացնել գլիցերիլ ֆոսֆատը:Բնության մեջ կա ֆոսֆոլիպազի 5 տեսակ՝ ֆոսֆոլիպազ A2 և ֆոսֆոլիպազ:

A., ֆոսֆոլիպազ B, ֆոսֆոլիպազ C և ֆոսֆոլիպազ D: Օձի թույնը հիմնականում պարունակում է ֆոսֆոլիպազ A2 (PLA2), օձերի մի քանի թույններ պարունակում են ֆոսֆոլիպազ B, իսկ այլ ֆոսֆոլիպազներ հիմնականում հայտնաբերված են կենդանիների հյուսվածքներում և բակտերիաներում:Նկար 3-11-4 ցույց է տալիս այս ֆոսֆոլիպազների գործողության վայրը սուբստրատի հիդրոլիզի վրա:

Ֆոսֆոլիպազներից ավելի շատ ուսումնասիրվել է PLA2-ը։Այն կարող է լինել օձի թույնի ամենաշատ ուսումնասիրված ֆերմենտը:Դրա սուբստրատը էսթերային կապն է Sn-3-գլիցերոֆոսֆատի երկրորդ դիրքի վրա:Այս ֆերմենտը լայնորեն հանդիպում է օձի թույնի, մեղվի թույնի, կարիճի թույնի և կենդանական հյուսվածքների մեջ, իսկ PLA2-ն առատ է օձերի չորս ընտանիքների թույններում:Քանի որ այս ֆերմենտը կոտրում է արյան կարմիր բջիջները և առաջացնում հեմոլիզ, այն նաև կոչվում է «հեմոլիզին»:Որոշ մարդիկ նաև անվանում են PLA2 հեմոլիտիկ լեցիտինազ:

Լյուդիկն առաջին անգամ պարզեց, որ օձի թույնը կարող է արտադրել հեմոլիտիկ միացություն՝ ազդելով լեցիտինի վրա ֆերմենտների միջոցով:Հետագայում Դելեզենը և այլք.ապացուցել է, որ երբ կոբրայի թույնը գործում է ձիու շիճուկի կամ դեղնուցի վրա, այն ձևավորում է հեմոլիտիկ նյութ։Այժմ հայտնի է, որ PLA2-ը կարող է ուղղակիորեն ազդել էրիթրոցիտների մեմբրանի ֆոսֆոլիպիդների վրա՝ քայքայելով էրիթրոցիտների մեմբրանի կառուցվածքը և առաջացնելով ուղղակի հեմոլիզ;Այն կարող է նաև ազդել շիճուկի կամ ավելացված լեցիտինի վրա՝ արտադրելու հեմոլիտիկ լեցիտին, որը գործում է արյան կարմիր բջիջների վրա՝ առաջացնելով անուղղակի հեմոլիզ:Չնայած PLA2-ն առատ է օձերի թույնի չորս ընտանիքներում, օձերի տարբեր թույնի մեջ ֆերմենտների պարունակությունը մի փոքր տարբերվում է:Ժողովրդական օձ (C

Օձի թույնը ցույց է տվել միայն թույլ PLA2 ակտիվություն:Աղյուսակ 3-11-11-ը ցույց է տալիս Չինաստանում թունավոր օձերի 10 հիմնական թույնի PLA2 ակտիվության համեմատությունը:

Աղյուսակ 3-11-11 Չինաստանում 10 օձերի թույնի ֆոսֆոլիպազ VIII գործունեության համեմատությունը

Օձի թույն

Ճարպի ազատում

Ալիֆատիկ թթու,

Սյումոլ/մգ)

Հեմոլիտիկ ակտիվություն CHU50/^ գ * մլ)

Օձի թույն

Ազատել ճարպաթթուները

(^ ռաոլ/մգ)

Հեմոլիտիկ ակտիվություն «(HU50/ftg * 1111)

Նաջանաջա ատրա

9. 62

տասնմեկ

Միկրացեֆալ օֆիս

հինգ կետ մեկ զրո

kalyspallas

8. 68

երկու հազար ութ հարյուր

gracilis

V, սուր

7. 56

* * #

Օֆիոֆագուս Հաննա

երեք միավոր ութ երկու

հարյուր քառասուն

Bnugarus fasctatus

7,56

երկու հարյուր ութսուն

B. multicinctus

մեկ միավոր ինը վեց

երկու հարյուր ութսուն

Viper եւ Russelli

յոթ կետ զրո երեք

T, mucrosquamatus

մեկ միավոր ութ հինգ

Սիամենսիս

T. stejnegeri

0. 97

(2) Տարանջատում և մաքրում

Օձի թույնի մեջ PLA2-ի պարունակությունը մեծ է, և այն կայուն է ջերմության, թթվային, ալկալիների և դենատուրանտների նկատմամբ, այնպես որ հեշտ է մաքրել և առանձնացնել PLA2-ը:Ընդհանուր մեթոդն այն է, որ սկզբում գել ֆիլտրացվի չմշակված թույնի վրա, այնուհետև անցկացվի իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա, և հաջորդ քայլը կարող է կրկնվել:Հարկ է նշել, որ իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիայից հետո PLA2-ի սառեցմամբ չորացումը չպետք է առաջացնի ագրեգացիա, քանի որ սառեցման գործընթացը հաճախ մեծացնում է իոնային ուժը համակարգում, ինչը կարևոր գործոն է, որն առաջացնում է PLA2-ի ագրեգացիա:Բացի վերը նշված ընդհանուր մեթոդներից, ընդունվել են նաև հետևյալ մեթոդները՝ ① Wells et al.② PLA2-ի ենթաշերտի անալոգը օգտագործվել է որպես կապակցման քրոմատագրման լիգանդ:Այս լիգանդը կարող է կապվել օձի թույնի PLA2-ի հետ Ca2+-ով:EDTA-ն հիմնականում օգտագործվում է որպես էլուենտ:Ca2+-ը հեռացնելուց հետո PLA2-ի և լիգանդի միջև կապը նվազում է, և այն կարող է տարանջատվել լիգանդից:Մյուսներն օգտագործում են 30% օրգանական լուծույթ կամ 6 մոլ/լ միզանյութ՝ որպես լուծիչ:③ Կատարվել է հիդրոֆոբ քրոմատոգրաֆիա PheiylSephar0SeCL-4B-ով` կարդիոտոքսինի մեջ PLA2-ի հետքը հեռացնելու համար:④ Anti PLA2 հակամարմինը օգտագործվել է որպես լիգանդ՝ PLA2-ի վրա մերձավոր քրոմատոգրաֆիա կատարելու համար:

Մինչ այժմ օձի թույնի մեծ քանակությամբ PLAZ-ը մաքրվել է։Tu et al.(1977 թ.) թվարկված PLA2-ը, որը մաքրվել է օձի թույնից մինչև 1975 թվականը: Վերջին տարիներին, ամեն տարի արձանագրվել են մեծ թվով հոդվածներ PLA2-ի առանձնացման և մաքրման մասին:Այստեղ մենք կենտրոնանում ենք չինացի գիտնականների կողմից PLA-ի առանձնացման և մաքրման վրա:

Չեն Յուանկոնգը և այլք:(1981) Չժեցզյանում Agkistrodon halys Pallas-ի թույնից առանձնացրեց երեք PLA2 տեսակ, որոնք ըստ իրենց իզոէլեկտրական կետերի կարելի է բաժանել թթվային, չեզոք և ալկալային PLA2-ի:Ըստ իր թունավորության, չեզոք PLA2-ն ավելի թունավոր է, որը նույնականացվել է որպես նախասինապտիկ նեյրոտոքսին Agkistrodotoxin:Ալկալային PLA2-ը պակաս թունավոր է, իսկ թթվային PLA2-ը գրեթե թունավորություն չունի:Wu Xiangfu et al.(1984) համեմատեց երեք PLA2-ների բնութագրերը, ներառյալ մոլեկուլային քաշը, ամինաթթուների կազմը, N-տերմինալը, իզոէլեկտրական կետը, ջերմային կայունությունը, ֆերմենտային ակտիվությունը, թունավորությունը և հեմոլիտիկ ակտիվությունը:Արդյունքները ցույց են տվել, որ դրանք ունեին նմանատիպ մոլեկուլային քաշ և ջերմային կայունություն, բայց զգալի տարբերություններ ունեին այլ առումներով:Ֆերմենտային ակտիվության առումով թթվային ֆերմենտային ակտիվությունը ավելի բարձր էր, քան ալկալային ֆերմենտի ակտիվությունը.Առնետների կարմիր արյան բջիջների վրա ալկալային ֆերմենտի հեմոլիտիկ ազդեցությունն ամենաուժեղն էր, որին հաջորդում էր չեզոք ֆերմենտը, իսկ թթվային ֆերմենտը գրեթե չէր հեմոլիզվում:Հետևաբար, ենթադրվում է, որ PLAZ-ի հեմոլիտիկ ազդեցությունը կապված է PLA2 մոլեկուլի լիցքավորման հետ:Zhang Jingkang et al.(1981) պատրաստել են ագկիստրոդոտոքսին բյուրեղներ:Tu Guangliang et al.(1983) զեկուցել է, որ 7.6 իզոէլեկտրական կետով թունավոր PLA մեկուսացվել և մաքրվել է Fujian-ից Vipera rotundus-ի թույնից և նրա ֆիզիկական և քիմիական հատկություններից, ամինաթթուների բաղադրությունից և 22 ամինաթթուների մնացորդներից N-ում: - տերմինալը որոշվել է.Լի Յուեշենգ և այլք:(1985) մեկուսացրեց և մաքրեց ևս մեկ PLA2-ը Ֆուջյանում Viper rotundus-ի թույնից:PLA2*-ի ենթամիավորը 13 800 է, իզոէլեկտրական կետը՝ 10,4, իսկ հատուկ ակտիվությունը՝ 35/xnioI/miri մգ։ Լեցիտինի դեպքում որպես սուբստրատ՝ ֆերմենտի օպտիմալ pH-ը 8,0 է, իսկ օպտիմալ ջերմաստիճանը՝ 65 °C։ LD5 ներարկվել է ներերակային մկների մեջ:Այն կազմում է 0,5 ± 0,12 մգ/կգ:Այս ֆերմենտն ունի ակնհայտ հակամակարդիչ և հեմոլիտիկ ազդեցություն։Թունավոր PLA2 մոլեկուլը բաղկացած է 18 տեսակի ամինաթթուների 123 մնացորդներից:Մոլեկուլը հարուստ է ցիստեինով (14), ասպարտիկ թթվով (14) և գլիցինով (12), բայց պարունակում է միայն մեկ մեթիոնին, և դրա N-տերմինալը սերինի մնացորդն է։Համեմատելով Tuguang-ի կողմից մեկուսացված PLA2-ի հետ, երկու իզոֆերմենտների մոլեկուլային քաշը և ամինաթթուների մնացորդների քանակը շատ նման են, և ամինաթթուների բաղադրությունը նույնպես շատ նման է, բայց ասպարտաթթվի և պրոլինի մնացորդների քանակը փոքր-ինչ տարբեր է:Guangxi king cobra օձի թույնը պարունակում է հարուստ PLA2:Շու Յույանը և այլք։(1989) թույնից առանձնացրել է PLA2, որն ունի բնօրինակ թույնից 3,6 անգամ բարձր հատուկ ակտիվություն, 13000 մոլեկուլային քաշ, 122 ամինաթթու մնացորդներից կազմված, 8,9 իզոէլեկտրական կետ և լավ ջերմային կայունություն։Էլեկտրոնային մանրադիտակով դիտարկելով հիմնական PLA2-ի ազդեցությունը կարմիր արյան բջիջների վրա, կարելի է տեսնել, որ այն ակնհայտ ազդեցություն ունի մարդու կարմիր արյան բջիջների մեմբրանի վրա, բայց ակնհայտ ազդեցություն չունի այծի կարմիր արյան բջիջների վրա:Այս PLA2-ն ակնհայտ դանդաղեցնող ազդեցություն ունի մարդկանց, այծերի, նապաստակների և ծովախոզուկների արյան կարմիր բջիջների էլեկտրոֆորետիկ արագության վրա:Chen et al.Այս ֆերմենտը կարող է արգելակել թրոմբոցիտների ագրեգացումը, որն առաջանում է ADP-ի, կոլագենի և նատրիումի արախիդոնաթթվի կողմից:Երբ PLA2 կոնցենտրացիան 10/xg/ml~lOOjug/ml է, թրոմբոցիտների ագրեգացիան ամբողջությամբ արգելակվում է:Եթե ​​որպես նյութ օգտագործվեին լվացված թրոմբոցիտները, PLA2-ը չէր կարող արգելակել ագրեգացիան 20 մգ/մլ կոնցենտրացիայի դեպքում:Ասպիրինը ցիկլօքսիգենազի արգելակիչ է, որը կարող է արգելակել PLA2-ի ազդեցությունը թրոմբոցիտների վրա:PLA2-ը կարող է արգելակել թրոմբոցիտների ագրեգացումը՝ հիդրոլիզացնելով արախիդոնաթթուն՝ թրոմբոքսան A2 սինթեզելու համար:Չժեցզյան նահանգում Agkistrodon halys Pallas թույնի կողմից արտադրված PLA2-ի լուծույթի կոնֆորմացիան ուսումնասիրվել է շրջանաձև երկխոսության, ֆլուորեսցենտության և ուլտրամանուշակագույն կլանման միջոցով:Փորձարարական արդյունքները ցույց են տվել, որ այս ֆերմենտի հիմնական շղթայի կոնֆորմացիան նման է այլ տեսակների և սեռերի նույն տեսակի ֆերմենտի, կմախքի կոնֆորմացիան ուներ լավ ջերմակայունություն, և թթվային միջավայրի կառուցվածքային փոփոխությունը շրջելի էր:Ակտիվացնող Ca2+ և ֆերմենտի համակցությունը չի ազդում տրիպտոֆանի մնացորդների միջավայրի վրա, մինչդեռ Zn2+ արգելակողն անում է հակառակը։Այն եղանակը, որով լուծույթի pH արժեքը ազդում է ֆերմենտի ակտիվության վրա, տարբերվում է վերը նշված ռեակտիվներից:

Օձի թույնի PLA2 մաքրման գործընթացում ակնհայտ երևույթն այն է, որ օձի թույնը պարունակում է երկու կամ ավելի PLA2 արտանետման գագաթներ:Այս երևույթը կարելի է բացատրել հետևյալ կերպ. ① իզոզիմների առկայության պատճառով;② PLA2-ի մի տեսակ պոլիմերացվում է տարբեր մոլեկուլային քաշ ունեցող PLA2 խառնուրդների մեջ, որոնց մեծ մասը գտնվում է 9 000-40 000 միջակայքում;③ PLA2-ի և օձի թույնի այլ բաղադրիչների համադրությունը բարդացնում է PLA2-ը;④ Քանի որ PLA2-ում ամիդային կապը հիդրոլիզացված է, լիցքը փոխվում է:① Եվ ② տարածված են, միայն մի քանի բացառություններով, ինչպիսիք են PLA2-ը CrWa/w օձի թույնի մեջ

Գոյություն ունի երկու իրավիճակ՝ ① և ②:Երրորդ պայմանը հայտնաբերվել է PLA2-ում հետևյալ օձերի թույնի մեջ՝ Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, պաղեստինյան իժ, ավազի իժ և սարսափելի ժխոր օձ:

④ դեպքի արդյունքում PLA2-ի միգրացիայի արագությունը փոխվում է էլեկտրոֆորեզի ժամանակ, բայց ամինաթթուների կազմը չի փոխվում:Պեպտիդները կարող են կոտրվել հիդրոլիզի միջոցով, բայց հիմնականում դրանք դեռևս կապված են դիսուլֆիդային կապերով։Արևելյան փոսային չախչախ օձի թույնը պարունակում է PLA2-ի երկու ձև, որոնք կոչվում են համապատասխանաբար a և տիպ p PLA2:PLA2-ի այս երկու տեսակների միջև տարբերությունը միայն մեկ ամինաթթու է, այսինքն՝ մեկ PLA2 մոլեկուլում գլուտամինը փոխարինվում է մյուս PLA2 մոլեկուլում գլուտամինաթթվով։Թեև այս տարբերության ճշգրիտ պատճառը պարզ չէ, ընդհանուր առմամբ ենթադրվում է, որ այն կապված է PLA2-ի դեամինացման հետ:Եթե ​​պաղեստինյան վիպերգի թույնի PLA2-ը տաք պահվի չմշակված թույնի հետ, ապա նրա ֆերմենտի մոլեկուլների վերջնական խմբերը կդառնան ավելի շատ, քան նախկինում:Օձի թույնից մեկուսացված C-ից PLA2-ն ունի երկու տարբեր N-տերմինալ, և նրա մոլեկուլային քաշը կազմում է 30000: Այս երևույթը կարող է առաջանալ PLA2-ի ասիմետրիկ դիմերի պատճառով, որը նման է արևելյան ալմաստե ախորժակի թույնի մեջ ձևավորված PLA2-ի սիմետրիկ դիմերին: և արևմտյան ադամանդյա խճճուկ օձ։Ասիական կոբրան կազմված է բազմաթիվ ենթատեսակներից, որոնցից մի քանիսը դասակարգման մեջ այնքան էլ որոշակի չեն:Օրինակ, այն, ինչ նախկինում կոչվում էր Կոբրա Արտաքին Կասպյան ենթատեսակ, այժմ ճանաչված է

Այն պետք է վերագրել Արտաքին Կասպից ծովի կոբրային:Քանի որ կան բազմաթիվ ենթատեսակներ և դրանք խառնվում են իրար, օձի թույնի բաղադրությունը շատ տարբեր է տարբեր աղբյուրների պատճառով, ինչպես նաև բարձր է PLA2 իզոզիմների պարունակությունը։Օրինակ՝ կոբրայի թույնը

Առնվազն 9 տեսակի PLA2 իզոզիմներ՝ r ^ ll տեսակների, և 7 տեսակի PLA2 իզոզիմներ՝ Caspian ենթատեսակի թույնի մեջ:Դուրկինը և այլք:(1981) ուսումնասիրել է PLA2-ի պարունակությունը և իզոզիմների քանակը տարբեր օձերի թույններում, այդ թվում՝ 18 կոբրայի թույն, 3 մամբայի թույն, 5 իժի թույն, 16 ժխոր օձի և 3 ծովային օձի թույն։Ընդհանուր առմամբ, կոբրայի թույնի PLA2 ակտիվությունը բարձր է՝ բազմաթիվ իզոզիմներով։Իժերի թույնի PLA2 ակտիվությունը և իզոզիմները միջին են։Մամբայի թույնի և չախչախ օձի թույնի PLA2 ակտիվությունը շատ ցածր է կամ բացակայում է PLA2 ակտիվությունը:Ցածր է նաև ծովային օձի թույնի PLA2 ակտիվությունը։

Վերջին տարիներին չի հաղորդվել, որ օձի թույնի մեջ PLA2-ը գոյություն ունի ակտիվ դիմերի տեսքով, ինչպիսին է արևելյան ռոմբոֆորա ժխխող օձը (C. օձի թույնը պարունակում է a և P տիպեր PLA2, որոնք երկուսն էլ կազմված են երկու նույնական ենթամիավորներից։ , և միայն դիմերազն ունի

Գործունեություն.Շենը և այլք։նաև առաջարկեց, որ օձի թույնի միայն PLA2-ի դիմերը ֆերմենտի ակտիվ ձևն է:Տարածական կառուցվածքի ուսումնասիրությունը նաև ապացուցում է, որ արևմտյան ալմաստե խոժոռ օձի PLA2 գոյություն ունի դիմերի տեսքով:Խոզակեր միացություն

Գոյություն ունեն օձի թույնի երկու տարբեր PLA ^ Ei և E2, որոնցում 仏 գոյություն ունի դիմերի տեսքով, դիմերը ակտիվ է, իսկ նրա տարանջատված մոնոմերը՝ ոչ ակտիվ։Lu Yinghua et al.(1980) հետագայում ուսումնասիրել են E. Jayanthi et al.-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները և ռեակցիայի կինետիկան:(1989) առանձնացրել է հիմնական PLA2 (VRVPL-V) իժի թույնից:PLA2 մոնոմերի մոլեկուլային զանգվածը 10000 է, որն ունի մահացու, հակամակարդիչ և այտուցային ազդեցություն:Ֆերմենտը կարող է պոլիմերացնել տարբեր մոլեկուլային քաշ ունեցող պոլիմերներ PH 4.8-ի պայմաններում, իսկ պոլիմերացման աստիճանը և պոլիմերների մոլեկուլային քաշը մեծանում են ջերմաստիճանի բարձրացման հետ։96 ° C-ում առաջացած պոլիմերի մոլեկուլային քաշը 53 100 է, և այս պոլիմերի PLA2 ակտիվությունը մեծանում է երկուսով